【光谱实验室：陈中博士 撰文】
【仪器设备：快速成像显微拉曼光谱仪】
【地点：4号楼220室 光谱实验室】

如何在WITec 拉曼上采集荧光寿命曲线，荧光寿命成像及拟合。

荧光寿命成像专用激光器

1． 如上图所示，打开荧光寿命成像专用的405nm 激光器，打开钥匙【ON】，预热5-10分钟，根据下表，在【TRIGGER】和【REP.FREQUENCY】的组合中选中所需的激光器的重频，将重频的对应值输入至软件中【Laser Repetition Rate [MHz]】的框内。

Oscillator	INT1	INT2
1	80MHz	1MHz
2	40MHz	500kHz
4	20MHz	250kHz
8	10MHz	125kHz
16	5MHz	62.5kHz
32	2.5MHz	31.25kHz

拉曼显微镜的光路图

2. 将拉曼显微镜的光路图调成如图的位置

3． 在软件中的主菜单最上面一栏 【Configurations】中下拉至 【Time Resolved Microscopy】

4． 在软件中【Time spectrograph】,设置参数，其中【Start Time】根据需要设置 ，一般设为3ns；【Time Bins】越高，采点数越密；【Time Bining】与时间窗口有关，设置为1时，时间窗口为15 ns，设置为N时，窗口为(15*N) ns。

5． 【Calibrate】校准步骤：

（1）先将激光器的【Shutter】旋扭顺时针旋至最小，同时在软件上将LED灯打开，亮度调到最低。【Calibrate】是利用LED灯的关源做的，所以执行过程中一定要保证LED灯打开。

（2）打开【Oscilloscope】，【Integration Time】设为【0.1s】，逆时针慢慢调节【Shutter】旋扭，观察频率窗口，所调频率不能超过激光重频的1%(弱荧光样品Shutter全开也不会超过1%)，否则有可能饱和，如果不小心将信号调节过强， 则探测器饱和，此时信号消失，需在【Detection】处点击【reset on】 复位。 在【Oscilloscope】预扫过程中，可以修改【Time spectrograph】内各项参数，直至合理。

（3）点击【Calibrate】，稳定2分钟左右，点击【SAVE】可保存此参数文件。

6． 荧光寿命单谱采谱和寿命拟合：

（1）在【Single spectrum】 设置好积分时间和积分次数后直接采谱，采集到寿命曲线如下图所示。

（2）将采集的单谱直接拖拽至【fittings】处，依次选择【Exponential】-【ExDecay】，然 后在曲线上按住【Shift】键将上升沿部分去掉，只拟合从最高点衰减的曲线。【Advanced Mode】可以显示更多参数，在【Fit Parameters】处观察是否有【Fit Successful】出现，此 时的 t值即为寿命值，点击【Fit and Extract All】, 提取所有曲线和寿命信息。

7． FLIM 荧光寿命成像

（1） 在【Oscilloscope】预扫时确定好【Integration Time】的数值，保证在此数值下能看到衰减曲线

（2） 在【Image scan】(区域<30um) 或者【Large Area Scan】的菜单下点开【Geometry】, 在【Listen Position】的下拉菜单在Video图像上选择成像区域，然后在【Points per line】和【Lines per Image】确定扫描点数，点击【Start Scan】或者【Start Large Area Scan】进行荧光寿命成像扫描，扫描的过程中会自动生成【Time Spectrograph】和【Time Spectrograph Count Rate】后缀的图像文件。

（3）成像拟合：扫完后生成【Time Spec.Ch 0】为后缀的文件，将此文件直接拖拽至【fittings】处，用鼠标在 【Time Spectrograph】和【Time Spectrograph Count Rate】的图像内移动，观察是否每个位置都是【Fit Successful】，然后点击【Fit and Extract All】导出四幅 图像 【Fit ExpDecay: y0】; 【Fit ExpDecay: x0】; 【Fit ExpDecay:Amp】; 【Fit ExpDecay: t】, 其中【Fit ExpDecay: t】为FLIM成像图，如下图所标， 荧光寿命成像所受测试条件变化的影响小，容易反映出样品的性质。

荧光光谱成像(左)和荧光寿命成像（右）