先天性心脏病（CHD），简称先心病，是最常见的出生缺陷之一，新生儿发病率约为1%。它也是导致一岁以下婴儿死亡的主要原因之一。随着医学和外科治疗的进步，大多数先心病患儿能够活到成年期，使得目前成年人先心病的流行率已远超过儿童。这些患者需要跨学科的持续监测和关怀，使先心病成为一种终身负担的高成本疾病。先心病的致病因素复杂，包括胎儿染色体异常、基因突变和母体环境因素等，已知的致病原因仅占总先心病的20-30%。过去五十年来，全球先心病的发病率持续上升，凸显了对先心病病因学研究的迫切需求。

最近，西湖大学施红军团队在 Genome Medicine 杂志上发表了题为 ENU-based dominant genetic screen identifies contractile and neuronal gene mutations in congenital heart disease 的最新研究成果。该研究进行了迄今为止最大规模的小鼠先心病正向显性遗传筛查。通过筛选一万多例小鼠心脏，发现了一千多例先心病，其疾病类型和分布与人群中的先心病发病情况极为相似，为鉴定新的先心病致病基因提供了基础。该研究首先建立了小鼠全基因组预期随机突变模型，并将实验观察到的突变频率与预期随机突变模型进行比对，鉴定与疾病显著相关的突变基因。同时，该研究首次对一千多例先心病人群携带的罕见显性遗传突变进行基因层面的遗传负担分析，并将人类基因分析结果与小鼠遗传筛选的结果相互验证。研究结果提示，基因突变导致的早期胎儿血流动力学改变可能是先天性心脏病的重要风险因素，并进一步提出了多基因致病模型，其中包括心脏收缩和神经调控基因，为先心病的预防和诊断提供了一个全新的视角。

文章链接：

https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-024-01372-x  

小鼠先心病正向显性遗传筛查

遗传因素被认为是先心病主要的致病因素。目前，大约有20%-30%的先心病病例可以通过遗传诊断确定，包括染色体异常，拷贝数变异，单基因变异等。约70%的先心病病因尚不明确，尤其是散发型先心病（没有家族病史），这提示了多基因遗传致病的可能性。

基于多基因显性致病的假设，本研究利用化学诱变剂ENU（N-乙基-N-亚硝基脲）对成年野生型雄鼠进行腹腔注射，诱发全身随机点突变，包括生殖细胞。随后，这些雄鼠与野生型雌鼠交配，使ENU诱导的随机突变在子代中自由重组。为了高效准确地检测胚胎小鼠的心脏缺陷，研究团队开发了一种基于光片显微镜的快速高分辨率心脏表型鉴定方法，每个心脏扫描成像时间缩短为30秒。

在完成的10285例胚胎小鼠表型筛查中，发现了1109例心脏缺陷。其中，室间隔缺损和二叶主动脉瓣畸形是最常见的表型，与人群中先心病的发病情况相符。值得注意的是，ENU诱变导致的心脏缺陷率高达10%，是人类先心病发病率的十倍，这符合遗传致病性的特征。鉴定的小鼠心脏缺陷代表图如图1所示。

图1.小鼠心脏缺陷代表图

建立预期突变模型 寻找先心病致病基因

本研究选取了720例心脏缺陷胚胎和611例同胎心脏结构正常的胚胎作为实验组和对照组，进行了全基因组或全外显子组测序。在大量的杂合子突变中寻找致病突变是本研究的难点。研究人员基于ENU的诱变特点、全基因组每个编码基因的转录本长度以及平均每只小鼠携带的ENU诱导的突变数，构建了小鼠全基因组的预期突变模型，并计算出每种突变类型的预期突变数目。基于这一预期突变模型，研究人员采用泊松分布和二项式分布检验，发现病例组中的破坏性突变数量明显多于对照组。针对这些破坏性突变所在的基因，进行了通路富集分析。结果显示，在疾病组中与心脏收缩相关的通路（主要包括Ryr2、Ryr3、Atp2a2、Atp2b2、Cacna1e、Cacna1s等细胞膜和内质网上的钙离子通道和离子泵）以及神经系统发育功能相关的通路显著富集。而在对照组中，并没有发现生物学通路的显著富集（参见图2）。

图2.心肌收缩及神经发育相关基因在心脏缺陷小鼠中显著富集

联合人类数据 揭示新的致病风险

为了验证小鼠实验中的发现，本研究对来自儿童心脏基因组学联盟（Pediatric Cardiac Genomics Consortium）的1457例先心病患者和千人基因组计划的2675例对照受试者进行了全外显子测序数据的分析。这些分析结果与小鼠实验的发现一致：在先心病患者中，与肌肉收缩和神经系统发育相关的基因显著富集。并且，进行GnomAD数据库突变发生频率分析发现，这些在先心病中富集的基因更不耐受功能丢失型突变和错义突变（参见图3）。

最后，研究提供了101个候选先心病致病双基因集，其中每对基因在至少一只小鼠和两例先心病患者中同时存在杂合子破坏性突变，而在对照组的小鼠、先心病患者的父母以及对照组受试者中均没有发现同时存在破坏性突变。

图3.肌肉及神经发育相关基因显著富集先心病人群中

这些研究结果揭示了在心脏发育过程中影响心脏节律和早期血流动力学变化的基因突变，可能作为遗传风险因素，在先天性心脏病的发病机制中扮演着前所未知的重要角色。进一步验证本研究中鉴定出的候选双基因集，有望深化我们对先天性心脏病复杂遗传学机制的理解，并有可能推动开发新的多基因诊断、筛查和预防方法。

西湖大学2018级博士生罗晓曦，西湖大学科研助理刘利峰为本研究的共同第一作者，西湖大学医学院施红军研究员是这一研究的通讯作者。本研究得到了浙江省自然科学基金项目(LZ19H040001)，西湖大学教育基金会和中国国家基因库的资助和支持。